Existe un interés creciente en producir proteína a partir de tejido vegetal, siendo alfalfa (Medicago sativa) uno de los modelos más estudiados. En el presente trabajo, se desarrolla un proceso con sistemas de dos fases acuosas (ATPS, de sus siglas en inglés) para obtener un concentrado de proteína libre de clorofila, a partir de tejido verde. Se llevó a cabo un diseño experimental factorial de dos niveles para estudiar los factores que interfieren con la recuperación de proteína total, empleando dos proteínas modelo (albumina de suero bovino y lisozima). Los factores de concentración de polímero y concentración total de proteina fueron estadísticamente significativos. A partir de dichos resultados, se aplicó el método estadístico de búsqueda de descenso por gradiente (steepest descent) y un diseño central compuesto para optimizar la recuperación de proteína total libre de clorofila a partir de tejido verde de alfalfa (Medicago sativa). Un concentrado con más de 80% y 51% de proteína se obtuvo en fase inferior líquida y liofilizada, respectivamente.